METODE ISTRAŽIVANJA
U provođenju projekta predviđene su različite aktivnosti kako bi se postigli očekivani ciljevi. Aktivnosti će biti podijeljene u šest radnih paketa. Svaki radni paket rezultirat će određenim rezultatima i/ili isporukama.
Radni paket 1. obuhvaća Organizacijske aktivnosti. One su preduvjet za uspješno provođenje projekta. Svrha radnog paketa je osigurati sve neophodne uvjete i uspješno organizirati implementaciju projekta.
Uvodni sastanak organizirat će se radi dogovora i prihvaćanja cjelokupnog radnog plana te pripreme detaljnog radnog plana za prvu godinu istraživanja.
Jedan poslijediplomski kandidat i jedan doktorand biti će zaposleni. Poslijediplomski kandidat će biti angažiran u svim aktivnostima vezanim za provedbu projekta. Doktorand će završiti disertaciju u okviru projekta. Znanstvenici, članovi projektnog tima, raspravljat će o mogućim temama disertacije, a odluka će biti donesena od strane mentora. Zajedno sa mentorom, doktorand će pripremiti prijedlog za prijavu teme doktorata i predati Fakultetskom vijeću. Na kraju projekta završit će se prva verzija doktorske disertacije.
Svakih šest mjeseci članovi projektnog tima (osim znanstvenika iz inozemstva) sastat će se i izvijestiti o trenutnim aktivnostima i napretku u provedbi projekta.
Financijsko upravljanje projektom provodit će se sukladno zakonskim propisima. Administrativna djelatnica Zavoda za poljoprivrednu zoologiju i djelatnici službe računovodstva Agronomskog fakulteta provodit će praćenje tijeka novca i troškova pod nadzorom voditeljice projekta u skladu sa zakonskim propisima. Financijski izvještaji pripremat će se za svaku godinu provedbe projekta.
Izvještavanje se smatra redovitom obavezom voditeljice projekta i nužno je da članovi projektnog tima podnose voditeljici napredak i rezultate za svaku podaktivnost u koju su uključeni. Članovi projektnog tima će podnositi usmene izvještaje svakih 6 mjeseci. Pisana izvješća dostavljat će se voditeljici jednom godišnje. Na temelju zaprimljenih izvješća, voditeljica će pripremiti izvješće za svaku godinu istraživanja. Završno izvješće bit će pripremljeno za završnu konferenciju na kojoj će biti raspravljeno između članova projektnog tima.
Radni paket 2. obuhvaća aktivnosti koje se odnose na otkrivanje i monitoring u polju rezistentnih populacija (pomoću biotestova) krumpirove zlatice i jabukova savijača. Aktivnosti se provode s ciljem ostvarivanja rezultata:
Otkrivanje rezistentnih populacija krumpirove zlatice biotestovima. Populacije krumpirove zlatice prikupit će se za svaku godinu, tijekom tri godine istraživanja, na 15 lokaliteta godišnje s područja uzgoja krumpira. Koordinate polja bit će georeferencirane uz pomoć GPS prijemnika. Odrasli oblici kukaca uzgajat će se u entomološkim kavezima kako bi odložili jaja te se razvile ličinke. Istraživanja će se provoditi na ličinkama trećeg razvojnog stadija. Nakon što odlože jaja, odrasli oblici čuvat će se radi daljnjih genetskih i geometrijsko morfometrijskih analiza. Netretirane biljke krumpira uzgajat će se na Agronomskom fakultetu Sveučilišta u Zagrebu, radi osiguranja svježe netretirane lisne mase tijekom laboratorijskih testova. U testovima će se koristiti osam djelatnih tvari koje ubrajamo u sljedeće skupine: organofosforne insekticide (klorpirifos), piretroide (alfacipermetrin, deltametrin, lambdacipermetrin) i neonikotinoide (imidakloprid, tiametoksam, acetamiprid i tiakloprid). Za laboratorijske testove slijedit će se IRAC metoda br. 007 (IRAC, 2016a). Nakon pripreme preciznih razrjeđenja čiste djelatne tvari u preporučenim dozama, svaki list namočit će se u pripremljenu otopinu tijekom pet sekundi i ostaviti na papiru da se osuši površina lista. Tako pripremljeni suhi listovi postavit će se u označene posude koje moraju biti prikladne za čuvanje dovoljne količine lisne mase u optimalnim uvjetima do tri dana. Najmanje 40 ličinki krumpirove zlatice koristit će se za svaki tretman u četiri ponavljanja. Rezultati će se prikazati kao postotak mortaliteta te će se korigirati prema netretiranoj kontroli, uz korištenje formule po Schneider–Orelli (1947). Svi prikupljeni rezultati obradit će se statistički analizom varijance pomoću programa ARM 9.0.5. te usporediti testom rangova po Tukey-u. Dobiveni rezultati prikazat će se u obliku izvješća koji će poslužiti u donošenju zaključaka o razini rezistentnosti odraslih oblika krumpirove zlatice prikupljenih iz različitih uzgojnih područja Hrvatske.
Otkrivanje rezistentnih populacija jabukova savijača biotestovima. Gusjenice u dijapauzi i odrasli oblici (mužjaci) jabukova savijača skupljat će se svake godine na području uzgoja jabuke tijekom trogodišnjih istraživanja na 15 lokaliteta godišnje. Koordinate voćnjaka bit će georeferencirane na terenu pomoću GPS prijemnika. Laboratorijski testovi obavit će se na laboratorijski uzgojenoj čistoj populaciji jabukova savijača i na populacijama prikupljenim na terenu. Čista populacija gusjenica jabukova savijača u dijapauzi nabavit će se iz Nacionalnog instituta za agronomska istraživanja Francuske (INRA, Avignon). U pokusima će se koristiti tri djelatne tvari iz skupina organofosfata (klorpirifos), piretroida (alfacipermetrin) i neonikotinoida (tiakloprid). Prema procedurama za utvrđivanje enzimatske aktivnosti (engl. GST, PSMO i EST) (Reyes i sur., 2007) i genetskih mutacija (engl. kdr i AChE mutacija) (Cassanelli i sur., 2006; Reyes i sur., 2007) provest će se analize rezistentnosti gusjenica jabukova savijača na spomenute djelatne tvari. Rezultati će se prikazati kao postotak mortaliteta te će se korigirati prema netretiranoj kontroli, uz korištenje formule po Schneider–Orelli (1947). Svi prikupljeni rezultati obradit će se statistički analizom varijance pomoću programa ARM 9.0.5. te usporediti testom rangova po Tukey-u. Obrađeni rezultati prikazat će se u obliku izvještaja koji će poslužiti u donošenju zaključaka o razini rezistentnosti jabukova savijača iz različitih uzgojnih područja Hrvatske. Nakon provedenih analiza, svi primjerci odraslih oblika jabukova savijača sačuvat će se za daljnje genetske i geometrijsko morfometrijske analize.
U svrhu izrade karte distribucije rezistentnih populacija. Na temelju dobivenih podataka o lokacijama rezistentnih populacija napravit će se baze podataka u GIS-u (Geografski informacijski sustav).
Radni paket 3. provest će se istraživanja utvrđivanja genetske strukture populacija štetnika s različitim razinama rezistentnosti.
Temeljem DNA mikrosatelitskih biljega procijenit će se genetska struktura, genetska varijabilnost, protok gena i širenje nerezistentnih populacija kukuruzne zlatice iz Hrvatske te nerezistentnih i rezistentnih populacija kukuruzne iz SAD-a (odakle potječu hrvatske populacije).
Temeljem utvrđenih biljega mitohondrijske DNA (mtDNA) i polimorfizma dužine umnoženih fragmenata (AFLP), procijenit će se genetska struktura, genetska varijabilnost, protok gena i širenje populacija krumpirove zlatice koje su analizirane biotestovima (utvrđen određeni stupanj rezistentnosti)
Temeljem DNA mikrosatelitskih biljega utvrdit će se enzimatska aktivnost (GST, PSMO i EST) te kdr i AChE mutacije populacija jabukova savijača koje su analizirane biotestovima (kod kojih je utvrđen određeni stupanj rezistentnosti), kao i rezistentne i nerezistentne populacije jabukova savijača iz Europe.
Radni paket 4. obuhvaća istraživanja koja se odnose na geometrijsko morfometrijske analize tijela i/ili krila kukaca. Cilj je razviti i optimizirati tehnike zasnovane na metodama geometrijske morfometrije za otkrivanje i praćenje nerezistentnih i rezistentnih populacija krumpirove zlatice, kukuruzne zlatice i jabukova savijača. Aktivnost je podijeljena sukladno štetnicima koji se istražuju u tri podaktivnosti. U prvoj godini obavit će se preliminarna istraživanja s ciljem utvrđivanja morfoloških biljega na tijelu i krilima koji će se koristiti u kasnijim istraživanjima.
Geometrijsko morfometrijske procedure su slijedeće: odabrani dijelovi tijela kukaca fotografiraju će se pomoću Leica DFC295 kamere ugrađene u Leica MZ16A stereo-mikroskop. Sve fotografije spremaju se u .tiff formatu pomoću Leica Application Suite V 3.8.0 (c2003-2011; Leica Microsystems Limited, Švicarska). Na tijelu kukca odabiru se dvije različite karakteristike, ventralna strana tijela te lijevo i desno krilo (stražnja krila).
Istraživanja antirezistentnih strategija čini radni paket 5. Svrha je istražiti mogućnosti suzbijanja krumpirove zlatice, kukuruzne zlatice i jabukova savijača korištenjem različitih metoda.
Izolacija autohtonih entomopatogenih nematoda (EPN), utvrđivanje njihove infektivnosti na spomenute štetnike i usporedba s komercijalno dostupnim vrstama nematoda. Izolacija autohtonih EPN provest će se prikupljanjem uzoraka tla na različitim lokalitetima u Hrvatskoj (15 lokaliteta na godinu), izolacijom nematoda iz uzoraka tla pomoću mamaca (vrsta Galleria mellonella kao mamac) i modificiranih bijelih mamaca za izolaciju nematoda iz inficiranih uginulih kukaca (White, 1927; Kaya i Stock, 1997).
Antirezistente strategije suzbijanja krumpirove zlatice će se sastojat od tri grupe istraživanja koja su vezana na ekološki prihvatljive metode i sredstva za suzbijanje. Rezultati provedenih istraživanja bit će temelj razvoja nove strategije suzbijanja krumpirove zlatice kojom se usporava razvoj rezistentnosti. Razvit će se nove alternative kemijskoj metodi suzbijanja. U trogodišnjim pokusima provedenima u drugoj, trećoj i četvrtoj godini projekta istražit će se učinkovitost ekološki prihvatljivih insekticida. U pokuse će biti uključeni mikrobiološki insekticidi (Bacillus thuringiensis var. tenebrionis i Beauveria bassiana) prirodni i sintetski naturaliti (spinosad and spinetoram) te će isti biti uspoređeni sa standardnim kemijskim insekticidom metaflumizonom. Poljski pokusi provest će se prema EPPO standardima PP 1/12(4) (EPPO, 2014). Utvrdit će se učinkovitost entomopatogenih nematoda Steinernema feltiae i Steinernema carpocapsae u poljskim uvjetima. Vrsta S. feltiae je prema navodima literature učinkovitija u hladnijim uvjetima (Trdan i sur., 2009) pa će se primijeniti na prezimjela imaga. Osim tretmana entomopatogenim nematodama, u pokus će biti uključeni jedan klasičan insekticid i netretirana kontrola. Učinkovitost će biti određena brojanjem živih ličinki i procjenom štete na listu. Cvjetne (floralne) atraktante koje su predložili Martel i sur. (2005) sintetizirat će Institut za zaštitu bilja u Budimpešti, a bit će primijenjeni na mjesta prezimljenja krumpirove zlatice i na nova polja krumpira na kojima će se primijeniti vrsta S. feltiae za suzbijanje prezimjelih imaga.
Razvijanje strategije zaštite od rezistentnih populacija jabukova savijača. Podaktivnost će se sastojati do tri grupe istraživanja koje su povezane s uporabom ekološki povoljnih metoda ili agenasa u zaštiti od rezistentnih populacija jabukova savijača. Na kraju istraživanja usvojit će se nova strategija zaštite koja će usporiti razvoj rezistentnih populacija te će se usvojiti nove alternativne metode zaštite. U trogodišnjem istraživanju uspostavit će se primjena ekološki povoljnijih, bioloških insekticida. Učinkovitost mikrobioloških insekticida (baziranih na virusu granuloze vrste Cydia pomonella) usporedit će se s učinkovitošću standardnih kemijskih insekticida (klorpirifos). Poljski pokusi obavit će se u skladu s EPPO standardom PP 1/7(3) (EPPO, 2014). Učinkovitost poljskog pokusa ocijenit će se brojanjem gusjenica u dijapauzi i procjenjivanjem postotka napadnutih gusjenica po pokusnoj površini. Učinkovitost entomopatogenih nematoda Steinernema carpocapsae u suzbijanju gusjenica u dijapauzi (smanjivanjem populacije odraslih oblika slijedećeg proljeća), procjenjivat će se u uzgojnom području jabuke. Pripravak S. carpocapse primjenjivat će se tijekom listopada folijarno i tretiranjem debla voćaka. Učinkovitost tretmana procijenit će se utvrđivanjem postotka napadnutih plodova slijedeće vegetacijske sezone. Utvrđene štete usporedit će se sa štetama zabilježenim na pokusnim površinama tretiranim standardnim kemijskim tretmanima i kontrolom (netretirana pokusna površina). Učinkovitost metode zbunjivanja (konfuzije), ekološki prihvatljive metode u suzbijanju jabukovog savijača diljem svijeta (Ciglar i sur., 2000), ispitat će se u voćnjacima jabuke te usporediti s konvencionalnim metodama zaštite (insekticidima). Na posljetku, na temelju rezultata istraživanja, razvit će se nova strategija zaštite koja će usporiti razvoj rezistentnosti jabukova savijača kao i nove alternativne metode zaštite.
Kao važan dio projekta, diseminacijske aktivnosti bit će organizirane u radnom paketu 6. Aktivnosti namijenjene su širenju znanja i spoznaja do ključnih interesnih skupina: znanstvene zajednice (putem objavljenih znanstvenih radova i sudjelovanja na konferencijama), stručnjaka savjetodavne službe, kreatora zakonodavne politike i proizvođača te stvaranju preduvjeta za dobru komunikaciju između znanstvenika i interesnih skupina čime se osigurava podrška pri uvođenju novo razvijenih strategija u poljoprivrednu proizvodnju kroz slijedeće podaktivnosti:
Kreiranje i održavanje web stranica;
Organiziranje tri radionice s poljoprivrednim proizvođačima (svaka s temom jednog od istraživanih štetnika);
Organiziranje tri radionice s uključivanjem djelatnika savjetodavne službe u projektne aktivnosti,
Članovi projektnog tima će sudjelovati u radionicama organiziranim od internacionalnih organizacija kako bi dijelili iskustva s drugim znanstvenicima koji se bave sličnom problematikom i kako bi raspravili postignute rezultate.
Rezultati provedenih istraživanja bit će prezentirani i na znanstvenim i stručnim kongresima i konferencijama. S obzirom na nacionalnu i internacionalnu važnost istraživanja predloženih projektom, predviđeno je sudjelovanje na domaćim i međunarodnim znanstvenim skupovima.
Na kraju projekta, pripremit će se printani materijal u obliku brošure u kojoj će se publicirati najvažniji rezultati projekta. Tiskani materijal bit će pripremljen za stručnjake i proizvođače i bit će distribuiran na završnoj konferenciji.
Svi konačni rezultati bit će prezentirani na završnoj konferenciji znanstvenoj i stručnoj javnosti i proizvođačima.
Ukupno je predviđeno da će predloženi projekt rezultirati objavom najmanje deset znanstvenih radova u prestižnim znanstvenim časopisima (s obzirom da su teme važne na međunarodnoj razini, a korištene metode inovativne smatramo da nema prepreka za ostvarenje ovog cilja).
